Durch eine Verkettung unglücklicher Umstände kommt es den Chipmunks zu Ohren, dass Dave seiner neuen Freundin in New York einen Heiratsantrag machen will. Durch ein Missverständnis glauben die drei singenden Nager plötzlich, dass Dave seine drei tierischen Freunde gegen eine feste Beziehung mit seiner Angebeteten eintauschen - sie also loswerden - will. Kurzerhand begeben der mutige Alvin, der schlaue Simon und der kleine Theodore sich also auf einen dreitägigen Road Trip nach New York City, um die drohende Verlobung zu verhindern.

Keiner kennt die Tiefen der sieben Meere besser als Dokumentarfilmer Steve Zissou, der mit seinem "Team Zissou" das Leben unter Wasser im U-Boot erforscht. Aber Steve hat schon bessere Zeiten erlebt und setzt nun alles auf eine Karte, um sich mit einer aufsehenerregenden und womöglich letzten Expedition einen Platz in der Geschichte zu sichern. Bei seiner letzten Expedition kam Steves Partner Esteban du Plantier ums Leben, weil ihn ein bis dahin unbekannter Jaguarhai angegriffen hat. Diesem seltsamen Geschöpf will Steve nun an den Kragen. Zu seinen Expeditionsteilnehmern gehören der verschrobene Deutsche Klaus Daimler, der Sicherheitsexperte Pelé dos Santos, Anne-Marie Sakowitz, Steves angeblicher Sohn Ned Plimpton und die schwangere Journalistin Jane Winslett-Richardson. Schon kurz nach der Abfahrt häufen sich die Probleme und Steves langjähriger Widersacher Alistair Hennessey macht die Aufgabe auch nicht leichter.