Der Archäologe Dr.Henry Jones wird, nachdem er von seinem französischen Kollegen Belloq nach einer Bergung aus einem Aztekengrab hereingelegt wurde, von Regierungsagenten auf die Bundeslade angesetzt, das Behältnis in dem Moses' Gesetzestafeln aufbewahrt wurden.Laut Geheiminformationen suchen die Nazis nach der Lade, da sie den Besitzer unbesiegbar machen soll. Jones, genannt Indiana Jones, reist daraufhin nach Nepal, wo er einen alten Kollegen aufspüren will, jedoch nur dessen Tochter findet, die sich an ihn ranhängt. Ein altes Schmuckstück führt sie nach Ägypten, wo die Nazis mit Belloqs Hilfe bereits Ausgrabungen vornehmen. So kommt es zum Wettlauf um die Auffindung der Quelle der Seelen, wo die Lade stehen soll. Doch auch nachdem die Lade aus der schlangenverseuchten Quelle geborgen ist, ist das Spiel noch lange nicht vorbei....

Zwei Jahre sind inzwischen vergangen, als Peter Parker von einer genmutierten Spinne gebissen wurde und sein Leben sich radikal verändert hat. Bei der Verbrechensbekämpferei lässt er sein College-Studium schleifen und verspätet sich permanent bei seinen beiden Jobs. Zu allem Überfluss muss Peter mit ansehen, wie Mary Jane im Gegensatz zu ihm ihr Leben meistert. Nun allerdings streckt ein neuer Bösewicht namens Dr. Octavius seine metallischen Tentakel nach der Zivilisation aus. Mit ihm ist nicht zu spaßen..