Ein Jahr nach den Anschlägen vom 11. September beteiligt sich die CIA-Analystin Maya an der Jagd auf den Terroristen Osama bin Laden. Es wird eine zermürbende, jahrelange Suche nach Hinweisen, bin Ladens Kontaktmännern und seinem Aufenthaltsort. Das Ganze wird begleitet von vielen Rückschlägen und sogar dem Tod einer engen Kollegin Mayas - bei einem Treffen mit einem Bin-Laden-Informant wird sie Opfer eines Bombenattentats. Immer fanatischer stürzt sich Maya in die Suche, bis sie den richtigen Treffer landet: Alles deutet darauf hin, dass sich bin Laden in einem Anwesen im pakistanischen Abottabad versteckt. Und Maya bekommt von ganz oben das "Go" für die Operation "Neptun's Spear", die in der Nacht vom 2. auf den 3. Mai 2011 um 00.30 Uhr, "Zero Dark Thirty", stattfindet.

Callum Lynch soll wegen Mordes hingerichtet werden, doch kurz bevor das Urteil vollstreckt wird, kommt er im Auftrag der Firma Abstergo Industries in die Einrichtung der Wissenschaftlerin Sophia Rikkin nach Madrid, wo Menschen mit hohem Gewaltpotenzial geheilt werden sollen. Nur wenig später erfährt Callum jedoch, dass hinter der Organisation des Generaldirektors Alan Rikkin die moderne Inkarnation des Templerordens steckt. Die Templer wollen den legendären Apfel Edens finden, um damit den freien Willen der Menschheit zu steuern - und Callum soll ihnen dabei behilflich sein. Mittels einer Maschine durchlebt er die Erinnerungen seines Vorfahren Aguilar de Nerha, einem Assassinen zur Zeit der Spanischen Inquisition. Doch während er in der Vergangenheit seine Mission ausführt, erlernt Callum immer mehr Fähigkeiten, die er in der Gegenwart gegen die Templer einsetzen kann...