Ausgerechnet jetzt, da er als Newcomer die etablierten Stars am Rande der Niederlage hat und nur noch ein Entscheidungsrennen aussteht, verfährt sich der etwas egomanische, aber sympathische Rennwagen Lightning McQueen in der Wüste. Er landet in dem abgelegenen Hinterwaldnest Radiator Springs, wo die Uhren eher wie in den 50ern gehen und man den ungestümen Raser nach Kollateralschäden ein paar Lektionen erteilt.

Im Schutze eines großen Riffs lebt die Familie von Clownsfisch Marlin relativ sicher und trotzdem werden seine Frau und nahezu alle seine Kinder Opfer eines gefräßigen Räubers. Das einzige ihm verbleibende Kind ist der kleine Nemo, der von da an besonders behütet wird. Doch die Neugier ist zu groß und prompt wird Nemo gefangen und zu den Menschen als Zierfisch gebracht. Durch ein paar Möwen erfährt Marlin alsbald, wo Nemo gelandet ist: im Aquarium eines Zahnarztes in Sydney. Mutig macht sich der Clownsfish mit seiner Freundin Dory, die allerdings ständig an Gedächtnisverlust leidet auf den Weg dorthin, wobei an Haien, Quallen und anderen Gefahren. Währenddessen ist Nemo nicht untätig und plant mit den anderen Aquariumsfischen einen gewagten Ausbruch aus ihrem Gefängnis...

In der Monster-AG-Fabrik gehen die Bösewichte eifrig ihrer Arbeit nach: Über Schranktüren schleichen sie sich in Kinderzimmer ein und sammeln die Angstschreie ihrer Bewohner, die den Strom für Monstropolis liefern. Ungekrönter Star unter den einfallsreichen "Schreckeinjagern" ist Sully. Dem passiert eines Tages ein folgenschweres Missgeschick: Das kleine Mädchen Boo, dem er wie gewohnt einen kräftigen Schock versetzen will, verkrallt sich in sein Fell. Als er dann mit dem Kind in die Fabrik zurückkehrt, bricht das totale Chaos aus...